熒光定量ＰＣＲ　實(shí)驗(yàn)步驟：

①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置５分鐘使其完全溶解。

②兩相分離　每１ｍｌ的ＴＲＩＺＯＬ試劑裂解的樣品中加入０．２ｍｌ的氯仿，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體１５秒后，１５到３０℃孵育２到３分鐘。４℃下１２０００ｒｐｍ離心１５分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無(wú)色水相上層。ＲＮＡ全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的ＴＲＩＺＯＬ試劑的６０％。

③ＲＮＡ沉淀　將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無(wú)ＲＮＡ酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的ＲＮＡ，混勻后１５到３０℃孵育１０分鐘后，于４℃下１２０００ｒｐｍ　離心１０分鐘。此時(shí)離心前不可見(jiàn)的ＲＮＡ沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。

④ＲＮＡ清洗　移去上清液，每１ｍｌＴＲＩＺＯＬ試劑裂解的樣品中加入**少１ｍｌ的７５％乙醇（７５％乙醇用ＤＥＰＣＨ２Ｏ配制），清洗ＲＮＡ沉淀?；靹蚝螅础嫦拢罚埃埃埃颍穑黼x心５分鐘。

⑤ＲＮＡ干燥　小心吸去大部分乙醇溶液，使ＲＮＡ沉淀在室溫空氣中干燥５－１０分鐘。

⑥溶解ＲＮＡ沉淀　溶解ＲＮＡ?xí)r，先加入無(wú)ＲＮＡ酶的水４０μｌ用槍反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的ＲＮＡ溶液保存于－８０℃待用?！。保┳贤馕辗y(cè)定

先用稀釋用的ＴＥ溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量ＲＮＡ溶液用ＴＥ稀釋（１：１００）后，讀取其在分光光度計(jì)２６０ｎｍ和２８０ｎｍ處的吸收值，測(cè)定ＲＮＡ溶液　濃度和純度。

①　濃度測(cè)定

Ａ２６０下讀值為１表示４０　μｇ　ＲＮＡ／ｍｌ。樣品ＲＮＡ濃度（μｇ／ｍｌ）計(jì)算公式為：Ａ２６０　×稀釋倍數(shù)×　４０　μｇ／ｍｌ。具體計(jì)算如下：

ＲＮＡ溶于４０　μｌ?。模牛校盟?，取５ｕｌ，１：１００稀釋**４９５μｌ的ＴＥ中，測(cè)得Ａ２６０?。健。埃玻?/p>

ＲＮＡ　濃度＝?。埃玻薄　粒保埃啊　粒矗啊ˇ蹋纾恚臁。健。福矗啊ˇ蹋纾恚臁』颉。埃福础ˇ蹋纾蹋?/p>

?。担酰煊脕?lái)測(cè)量以后，剩余樣品ＲＮＡ為３５　μｌ，剩余ＲＮＡ總量為：

３５　μｌ　×?。埃福础ˇ蹋纾蹋臁。健。玻梗础ˇ蹋?/p>

②純度檢測(cè)

ＲＮＡ溶液的Ａ２６０／Ａ２８０的比值即為ＲＮＡ純度，比值范圍１．８到２．１。

２）變性瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定

①制膠

１ｇ瓊脂糖溶于７２ｍｌ水中，冷卻**６０℃，１０?。恚斓模保啊痢。停希校与娪揪彌_液和１８　ｍｌ的３７％　甲醛溶液（１２．３?。停?。

１０×ＭＯＰＳ電泳緩沖液

濃度　成分

０．４Ｍ?。停希校?，ｐＨ　７．０

０．１Ｍ　乙酸鈉

０．０１Ｍ?。牛模裕?/p>

灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔**少可以加入２５　μｌ溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的１×ＭＯＰＳ電泳緩沖液**覆蓋膠面幾個(gè)毫米。

②準(zhǔn)備ＲＮＡ樣品

?。肠蹋纾遥危?，加３倍體積的甲醛上樣染液，加ＥＢ于甲醛上樣染液中**終濃度為１０μｇ／ｍｌ。加熱**７０℃孵育１５分鐘使樣品變性。

③電泳

上樣前凝膠須預(yù)電泳５ｍｉｎ，隨后將樣品加入上樣孔。５–６Ｖ／ｃｍ電壓下２ｈ，電泳**溴酚蘭指示劑進(jìn)膠**少２–３ｃｍ。

④紫外透射光下觀察并拍照

２８Ｓ和１８Ｓ核糖體ＲＮＡ的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提ＲＮＡ的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的２倍。還有可能觀察到一個(gè)更小稍微擴(kuò)散的帶，它由低分子量的ＲＮＡ（ｔＲＮＡ和５Ｓ核糖體ＲＮＡ）組成。在１８Ｓ和２８Ｓ核糖體帶之間可以看到一片彌散的ＥＢ染色物質(zhì)，可能是由ｍＲＮＡ和其它異型ＲＮＡ組成。ＲＮＡ制備過(guò)程中如果出現(xiàn)ＤＮＡ污染，將會(huì)在２８Ｓ核糖體ＲＮＡ帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶，ＲＮＡ的降解表現(xiàn)為核糖體ＲＮＡ帶的彌散。用數(shù)碼照相機(jī)拍下電泳結(jié)果?！、俜磻?yīng)體系　序號(hào)　反應(yīng)物　劑量?。薄∧孓D(zhuǎn)錄ｂｕｆｆｅｒ?。拨蹋臁。病∩嫌我铩。埃拨蹋臁。场∠掠我铩。埃拨蹋臁。础。洌危裕小。埃宝蹋臁。怠∧孓D(zhuǎn)錄酶ＭＭＬＶ　０．５μｌ?。丁。模牛校盟。郸蹋臁。贰。遥危聊０妗。拨蹋臁。浮】傮w積?。保唉蹋臁≥p彈管底將溶液混合，６０００ｒｐｍ短暫離心。

②混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶ＭＭＬＶ　之前先７０℃干浴３分鐘，取出后立即冰水浴**管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶０．５μｌ，３７℃水?。叮胺昼?。

③取出后立即９５℃干?。撤昼?，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為ｃＤＮＡ溶液，保存于－８０℃待用?！」芗一颍é拢幔悖簦椋睿?shí)時(shí)定量ＰＣＲ

①β－ａｃｔｉｎ陽(yáng)性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備　陽(yáng)性模板的濃度為１０１１，反應(yīng)前?。肠蹋彀矗保氨断♂專铀玻乏蹋觳⒊浞只靹颍椋保埃保?，依次稀釋**１０９、１０８、１０７、１０６、１０５、１０４，以備用。

②反應(yīng)體系如下：

標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系　序號(hào)　反應(yīng)物　劑量　１?。樱伲拢摇。牵颍澹澹睢。薄∪玖稀。保唉蹋臁。病￡?yáng)性模板上游引物Ｆ?。埃郸蹋臁。场￡?yáng)性模板下游引物Ｒ?。埃郸蹋臁。础。洌危裕小。埃郸蹋臁。怠。裕幔衩浮。宝蹋臁。丁￡?yáng)性模板ＤＮＡ?。郸蹋臁。贰。洌洌龋玻稀。常玻郸蹋臁。浮】傮w積?。担唉蹋臁≥p彈管底將溶液混合，６０００ｒｐｍ短暫離心。

管家基因反應(yīng)體系：　序號(hào)　反應(yīng)物　劑量?。薄。樱伲拢摇。牵颍澹澹睢。薄∪玖稀。保唉蹋臁。病?nèi)參照上游引物Ｆ?。埃郸蹋臁。场?nèi)參照下游引物Ｒ?。埃郸蹋臁。础。洌危裕小。埃郸蹋臁。怠。裕幔衩浮。宝蹋臁。丁〈郎y(cè)樣品ｃＤＮＡ?。郸蹋臁。贰。洌洌龋玻稀。常玻郸蹋臁。浮】傮w積　５０μｌ　輕彈管底將溶液混合，６０００ｒｐｍ短暫離心。

③制備好的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)樣本同時(shí)上機(jī)，反應(yīng)條件為：９３℃２分鐘，然后９３℃?。狈昼?，５５℃?。卜昼?，共４０個(gè)循環(huán)?！、籴槍?duì)每一需要測(cè)量的基因，選擇一確定表達(dá)該基因的ｃＤＮＡ模板進(jìn)行ＰＣＲ反應(yīng)。

反應(yīng)體系：　序號(hào)　反應(yīng)物　劑量?。薄。保啊粒校茫揖彌_液?。玻怠。酰臁。病。停纾茫欤踩芤骸。保怠。酰臁。场∩嫌我铮啤。埃怠。酰臁。础∠掠我铮摇。埃怠。酰臁。怠。洌危裕谢旌弦骸。场。酰臁。丁。裕幔窬酆厦浮。薄。酰臁。贰。悖模危痢。薄。酰臁。浮〖铀?*總體積為?。玻担酰臁≥p彈管底將溶液混合，６０００ｒｐｍ短暫離心。

３５個(gè)ＰＣＲ循環(huán)（９４℃１分鐘；５５℃１分鐘；７２℃１分鐘）；　７２℃延伸５分鐘。

②ＰＣＲ產(chǎn)物與?。模危痢。蹋幔洌洌澹蛟冢玻キ傊悄z電泳，溴化乙錠染色，檢測(cè)ＰＣＲ產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。

③將ＰＣＲ產(chǎn)物進(jìn)行１０倍梯度稀釋：　設(shè)定ＰＣＲ產(chǎn)物濃度為１×１０１０，依次稀釋**１０９、１０８、１０７、１０６、１０５、１０４幾個(gè)濃度梯度?！、偎校悖模危翗悠贩謩e配置實(shí)時(shí)定量?。校茫曳磻?yīng)體系。

體系配置如下：　序號(hào)　反應(yīng)物　劑量?。薄。樱伲拢摇。牵颍澹澹睢。薄∪玖稀。保啊。酰臁。病∩嫌我铩。保酰臁。场∠掠我铩。保酰臁。础。洌危裕小。保酰臁。怠。裕幔窬酆厦浮。玻酰臁。丁〈郎y(cè)樣品ｃＤＮＡ?。担酰臁。贰。洌洌龋玻稀。常埃酰臁。浮】傮w積　５０?。酰臁≥p彈管底將溶液混合，６０００ｒｐｍ短暫離心。

②將配制好的ＰＣＲ反應(yīng)溶液置于Ｒｅａｌｔｉｍｅ?。校茫覂x上進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：９３℃２分鐘預(yù)變性，然后按９３℃?。狈昼?，５５℃１分鐘，７２℃１分鐘，共４０做個(gè)循環(huán)，**后７２℃７分鐘延伸。　各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行Ｒｅａｌｔｉｍｅ?。校茫曳磻?yīng)。ＰＣＲ產(chǎn)物與?。模危痢。蹋幔洌洌澹蛟冢玻キ傊悄z電泳，ＧｏｌｄＶｉｅｗ染色，檢測(cè)ＰＣＲ產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。

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