定義
實時熒光ＰＣＲ分析儀是一種將傳統(tǒng)ＰＣＲ擴增與熒光信號檢測同步進行的高精度分子生物學(xué)設(shè)備。通過在ＰＣＲ反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記物（探針或染料），實時監(jiān)測擴增過程中熒光強度的變化，實現(xiàn)對目標(biāo)核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）的定量（**／相對）或定性分析，無需后期電泳檢測。
核心原理
ＰＣＲ擴增基礎(chǔ)
遵循聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ＰＣＲ）三步驟：變性（高溫解鏈ＤＮＡ）、退火（引物結(jié)合模板）、延伸（合成新鏈）。
熒光信號生成
ＴａｑＭａｎ探針：５＇端報告基團（ＦＡＭ），３＇端淬滅基團（ＴＡＭＲＡ），水解后釋放熒光。
分子信標(biāo)：莖環(huán)結(jié)構(gòu)，結(jié)合靶序列后發(fā)夾打開，熒光恢復(fù)。
雙雜交探針：相鄰探針發(fā)生ＦＲＥＴ能量轉(zhuǎn)移產(chǎn)生熒光。
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ等染料嵌入雙鏈ＤＮＡ，發(fā)射熒光（強度與產(chǎn)物量成正比）。
缺點：易受非特異產(chǎn)物干擾。
熒光染料法（非特異性）：
熒光探針法（特異性）：
實時監(jiān)測
每輪循環(huán)結(jié)束時檢測熒光強度，生成擴增曲線。
閾值線（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）：背景熒光以上的設(shè)定值，與Ｃｔ值相關(guān)。
Ｃｔ值（Ｃｙｃｌｅ?。裕瑁颍澹螅瑁铮欤洌簾晒鈴姸冗_到閾值時的循環(huán)數(shù)，與起始模板量負相關(guān)（定量依據(jù)）。
核心組件
| 組件 | 功能 |
|---|---|
| 熱循環(huán)模塊 | 精確控制溫度（±０．１℃），實現(xiàn)變性、退火、延伸的快速切換。 |
| 光學(xué)檢測系統(tǒng) | － 光源：ＬＥＤ、鹵鎢燈或激光器 － 濾光片／光柵：選擇激發(fā)／發(fā)射波長 － 檢測器：ＣＣＤ或ＰＭＴ捕獲熒光信號 |
| 多通道檢測 | 支持４－６色熒光通道（如ＦＡＭ，?。龋牛兀。遥希兀。茫担瑢崿F(xiàn)多重檢測。 |
| 溫控技術(shù) | － Ｐｅｌｔｉｅｒ半導(dǎo)體溫控：主流技術(shù) － 離心式空氣加熱（快速ＰＣＲ儀） |
| 軟件與分析模塊 | 控制儀器運行，分析擴增曲線、計算Ｃｔ值、生成標(biāo)準(zhǔn)曲線、輸出定量／熔解曲線結(jié)果。 |
工作流程
樣本準(zhǔn)備：提取核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ），構(gòu)建反應(yīng)體系（引物、探針、酶、ｄＮＴＰｓ）。
加樣：轉(zhuǎn)移**專用ＰＣＲ管或９６／３８４孔板。
程序設(shè)置：
溫度程序（預(yù)變性→循環(huán)擴增→延伸）
熒光通道選擇（根據(jù)染料／探針波長）
實時監(jiān)測：每輪循環(huán)結(jié)束采集熒光信號。
數(shù)據(jù)分析：
定量分析：通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算模板拷貝數(shù)（**定量）或相對表達量（如２＜ｓｕｐ＞?ΔΔＣｔ＜／ｓｕｐ＞法）。
定性分析：熔解曲線分析（ＳＹＢＲ?。牵颍澹澹罘炞C產(chǎn)物特異性）。
陽性判定：Ｃｔ值≤預(yù)設(shè)閾值（通常３５－４０）。
關(guān)鍵性能參數(shù)
| 參數(shù) | 意義 |
|---|---|
| 檢測靈敏度 | **低可檢出模板量（可達單拷貝級別）。 |
| 動態(tài)范圍 | 可準(zhǔn)確定量的濃度范圍（通?？缭剑叮競€數(shù)量級）。 |
| 分辨率 | 區(qū)分濃度差異的能力（如±１．５倍差異）。 |
| 通量 | 單次運行樣本數(shù)（９６孔／３８４孔板，高通量機型支持數(shù)千樣本／天）。 |
| 升溫／降溫速率 | 影響ＰＣＲ速度（常規(guī)儀器：３－５°Ｃ／秒；快速ＰＣＲ儀：＞１０°Ｃ／秒）。 |
| 多色檢測能力 | 支持同步檢測的熒光通道數(shù)（４－６通道為主）。 |
主要應(yīng)用領(lǐng)域
病原體檢測
病毒（ＣＯＶＩＤ－１９、流感、ＨＩＶ）、**（結(jié)核分枝桿菌）、寄生蟲的快速診斷。
基因表達分析
ｍＲＮＡ定量（ｑＲＴ－ＰＣＲ），研究基因調(diào)控機制。
基因分型與突變檢測
ＳＮＰ分析、插入／缺失鑒定（探針法或熔解曲線分析）。
轉(zhuǎn)基因檢測
食品／作物中轉(zhuǎn)基因成分定量（如３５Ｓ啟動子、ＮＯＳ終止子）。
**開發(fā)與藥效評估
靶基因表達水平監(jiān)測。
法醫(yī)學(xué)
ＤＮＡ指紋圖譜、親子鑒定。
優(yōu)勢與局限性
| 優(yōu)勢 | 局限性 |
|---|---|
| ? 高靈敏度與特異性 | ? 易受抑制劑影響（血色素、肝素等） |
| ? 閉管操作，降低污染風(fēng)險 | ? 引物／探針設(shè)計難度高（尤其多重檢測） |
| ? 定量范圍廣，無需后期處理 | ? 設(shè)備及試劑成本較高 |
| ? 快速獲得結(jié)果（１－２小時） | ? 對實驗操作規(guī)范性要求嚴(yán)格 |
| ? 支持多重檢測（多靶標(biāo)同步分析） | ? **定量需標(biāo)準(zhǔn)品（增加復(fù)雜性） |
使用注意事項
防污染措施：
分區(qū)域操作（試劑準(zhǔn)備區(qū)→樣本處理區(qū)→擴增區(qū)）。
使用帶濾芯吸頭、ＵＶ燈**工作臺。
質(zhì)量控制：
設(shè)置陰性對照（無模板）、陽性對照、內(nèi)參基因（如ＧＡＰＤＨ）。
探針／染料選擇：
多重檢測需避免光譜重疊。
ＲＮＡ檢測：
需逆轉(zhuǎn)錄步驟（ｑＲＴ－ＰＣＲ），嚴(yán)防ＲＮＡ酶污染。
發(fā)展趨勢
便攜化與現(xiàn)場檢測
手持式／床旁快速ＰＣＲ儀（如用于突發(fā)疫情現(xiàn)場篩查）。
自動化整合
與核酸提取儀、液體處理工作站聯(lián)用，構(gòu)建全自動檢測線。
數(shù)字ＰＣＲ（ｄＰＣＲ）互補
提供**定量無需標(biāo)準(zhǔn)曲線，適用于低豐度靶標(biāo)分析。
多重檢測能力提升
發(fā)展１０色以上熒光系統(tǒng)，實現(xiàn)超多重靶標(biāo)同步檢測。
ＡＩ輔助分析
自動識別異常擴增曲線，優(yōu)化結(jié)果判讀準(zhǔn)確性。
代表廠商與機型
賽默飛世爾（Ｔｈｅｒｍｏ?。疲椋螅瑁澹颍海眩酰幔睿簦樱簦酰洌椋铩。担?，?。樱簦澹穑希睿澹校欤酰?/p>
伯樂（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）：ＣＦＸ９６／３８４，?。茫疲亍。希穑酰?/p>
羅氏（Ｒｏｃｈｅ）：ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ?。矗福埃梗?/p>
安捷倫（Ａｇｉｌｅｎｔ）：ＡｒｉａＭｘ
國產(chǎn)平臺：宏石（ＳＬＡＮ）、博日（ＬｉｎｅＧｅｎｅ）
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